Honourprogramma: Koemelkallergie in een buisje

Eveline Gouw, Honoursstudente aan het institute for Life Sciences & Chemistry schreef in samenwerking met Bioceros en het Lectoraat Innovative Testing in Life Sciences & Chemistry een literatuurverslag over hoe allergische eigenschappen van voedingsproducten (koemelkeiwitten) kunnen worden vastgesteld zonder daarbij proefdieren te gebruiken. Het volledige artikel kun je hieronder lezen.

Inleiding

Allergieën komen tegenwoordig steeds vaker voor onder mensen en er wordt hiernaar steeds meer onderzoek gedaan. De ontwikkeling van een allergie komt door omgevingsfactoren en genetische factoren; de erfelijke variant staat bekend als atopie, de aanleg voor de overproductie van IgE (Hodge & Sayers, 2013). Koemelk allergie is de meest voorkomende allergie bij jonge kinderen, ongeveer 3%, en komt vaak voort uit het starten met flesvoeding. Op het moment dat de baby allergisch is reageert zijn immuunsysteem op de koemelkeiwitten waardoor het spijsverteringskanaal ontstoken raakt (Fitplein B.V., 2014).
Een voedselallergie is gedefinieerd als een hyperactief immunologische reactie (hypersensitiviteit) op voedsel en kan worden verdeeld in IgE-gemedieerde en niet-IgE-gemedieerde reacties. Allergische reacties met acute symptomen na inname vallen meestal onder de IgE-gemedieerde reacties en hebben op meerdere organen effect: de huid (netelroos/angio-oedeem), het ademhalingssysteem (astma), het spijsverteringssysteem (pijn/overgeven/diarree) en het cardiovasculaire systeem (anafylactische shock). In IgE-gemedieerde reacties vindt crosslinking plaats tussen een allergeen en de membraan gebonden IgE’s van basofielen en/of mastcellen, wat vervolgens het uitscheiden van ontstekingsmediatoren activeert. De optimale condities voor het uitscheiden van deze mediatoren hangt af van de concentratie allergeen-specifieke IgE’s op het membraan, de concentratie allergenen en de affiniteit van de IgE voor het allergeen (Knipping et al., 2012).

In vitro degranulatie assay

Als mogelijke melkvervanger voor kinderen met een koemelkallergie zijn koemelk hydrolysaten ontwikkelt. De allergene epitopen van de eiwitten uit de koemelk zijn hierin zodanig verzwakt, met behulp van hydrolyse, dat deze geen allergische reactie meer zouden moeten kunnen veroorzaken.
Om aan te kunnen tonen of deze koemelkhydrolysaten daadwerkelijk geen allergische reactie meer kunnen veroorzaken zijn verschillende testmethodes beschikbaar. Voor de analyse van de peptiden wordt vooral HPLC, vloeistofchromatografie-massa spectrometrie, gelpermeatiechromatografie en SDS-PAGE gebruikt, en voor het testen van de antigeniciteit wordt vooral gebruik gemaakt van ELISA en Western blotting (Knipping et al., 2012).
Deze testmethoden zeggen nog niet erg veel over hoe de koemelkhydrolysaten zich zullen gedragen in vivo, en voor er getest mag worden in vivo zijn er nog accurate in vitro methodes nodig. Hierom heeft Bioceros een in vitro assay ontwikkeld waarbij er wordt getest op degranulatie door allergenen.
In deze assay wordt gebruik gemaakt van basofiele granulocyten (afkomstig van de rat) gekloneerd met humane IgE receptoren die vervolgens worden blootgesteld aan het te testen allergeen, in dit geval koemelk hydrolysaten. Om bij deze cellen een reactie te krijgen is croslinking nodig van de membraan gebonden IgE-receptoren met de IgE-allergeen complexen.
De humane IgE’s die nodig zijn voor deze test zijn in beperkte maten beschikbaar en variëren te veel doordat het afkomstig is van verschillende donoren. Hierdoor bestaat het serum steeds uit een andere concentratie IgE’s waardoor de resultaten van de in vitro assay veel zullen variëren. Vanwege deze beperkingen van het te verkrijgen humane IgE is er voor gekozen om de antilichamen op een andere manier te verkrijgen.

Verkrijgen van antilichamen

Om de antilichamen te verkrijgen worden muizen geïmmuniseerd met het allergeen. Hierdoor worden B cellen geactiveerd die antilichamen gaan aanmaken voor dit allergeen. De gevormde B cellen worden vervolgens geïsoleerd uit de milt en worden gefuseerd met myeloma cellen. Omdat de B cellen gefuseerd zijn met myeloma cellen zullen deze ongeremd kunnen groeien en antilichamen aan kunnen maken. Deze fusie cellijn worden Hybridoma cellen genoemd. De Hybridoma cellen worden vervolgens zo opgekweekt dat ze per cel te isoleren zijn. Dit is nodig omdat elke Hybridoma uit één specifieke B cel bestaat die allemaal een ander antilichaam zullen aanmaken. Deze antilichamen worden later gezuiverd en zullen vooral bestaan uit IgG’s.

Selectie van antilichamen en DNA synthese

Een antilichaam is opgebouwd uit twee zware en twee lichte polipeptideketens die bij elkaar gehouden worden door covalente en niet-covalente bindingen. Elk antilichaam bestaat vervolgens weer uit een constant en variabel deel en de specificiteit wordt bepaald door het variabele deel in combinatie met de koppeling van de zware en lichte ketens. Door deze variaties binden antilichamen zeer specifiek (Zouali, 2010). Van de gezuiverde antilichamen wordt een selectie gemaakt van rond de vijf antilichamen die allemaal specifiek op één epitoop van het allergeen binden, er mag dus geen crosslinking plaatsvinden. Dit wordt gedaan zodat er later geen competitie tussen de antilichamen kan ontstaan.
Na selectie van de antilichamen wordt op DNA niveau bepaald wat de sequentie is van het variabele deel; het deel wat de binding van het antilichaam bepaalt. De sequentie voor het variabele deel van de muizen IgG wordt vervolgens voor de sequentie van het constante deel van het humane IgE gezet. Hierdoor zal er een chimere antistof met een humane antistofbackbone ontstaan. Vóór de IgG-IgE sequenties wordt een sterke promotor geplaatst voor een optimale transcriptie, en achter deze sequenties wordt een secretie signaal geplaatst om de cel het antilichaam uit te laten scheiden.

Figuur 1. A) Opbouw van een antilichaam. Met links aangegeven de zware en lichte ketens, en rechts aangegeven het constante en variable deel. De covalente bindingen zijn zwavelbruggen (aangegeven met S-S) en N-gekoppelde suikergroepen. B) Schematische weergaven van een allergeen waaraan verschillende antilichamen (oranje, blauw en paars) gebonden zijn. Het paarse antilichaam heeft een variabel domein die te veel lijkt op het variabele domein van het blauwe antilichaam en zal dus niet geselecteerd worden uit alle verkregen antilichamen. C) Weergave van een chimere antistof met een humane antistofbackbone. Het variabele deel (oranje) van de muizen IgG en het constante deel (groen) van de humane IgE. D) Gesynthetiseerde DNA met de sterke promoter, de antilichaam sequentie met het variabele deel van IgG en het constante deel van IgE en een secretie signaal om het antilichaam uit te scheiden (Figuur: Eveline Gouw, 2013).

Het stukje DNA wordt vervolgens geplaatst in een vector. De vector wordt getranfecteerd in HEK cellen (Human Embryonal Kidney cells) die vervolgens de vector afschrijven en chimere antistoffen zullen vormen. Door het secretiesignaal zullen de antilichamen worden uitgescheiden en zo in het supernatant terecht komen.
De cellen worden afgedraaid zodat de antilichamen gezuiverd kunnen worden vanuit het supernatant en gebruikt kunnen worden voor de in vitro assays.

Voordelen van deze techniek

Enkele voordelen van deze techniek zijn dat de antilichamen die gebruikt worden voor de in vitro assay altijd het zelfde zijn en ongelimiteerd aanwezig zijn. Dit omdat het altijd van de zelfde vector afkomstig is en telkens opnieuw gesynthetiseerd kan worden. Doordat er voor deze nieuwe techniek niet gebruik wordt gemaakt van humaan serum maar van gesynthetiseerd serum, heeft deze assay veel minder achtergrond degranulatie. Het humane serum, gebruikt in de oude methode, bevat veel andere stoffen naast de antilichamen, waardoor de achtergrond in de assays over het algemeen hoog uit vielen. Doordat er nu in de nieuwe methode gebruik gemaakt wordt van serum met alleen de antilichamen valt deze achtergrond veel lager uit.
Een onverwacht maar heel praktisch voordeel is dat de assay door het gebruik van deze chimere antistoffen veel gevoeliger is geworden, en dus betere resultaten kan neer zetten dan de oude methode.

Eventuele toepassingen

Deze nieuw ontwikkelde techniek leent zich voor veel verschillende onderzoeksrichtingen. Hierbij kan gedacht worden aan onderzoek naar andere voedselallergieën, door in plaats van koemelkeiwitten andere vaak-allergene eiwitten te gebruiken n hier chimere antilichamen van te maken (L. Boon, L.W. van den Elsen, 2013).
Ook kan er gekeken worden naar de effectiviteit van chimere antistoffen in antitumortherapie. In deze richting wordt op het moment veel onderzoek gedaan naar de mogelijkheid antilichamen te gebruiken voor bindingsplaats-specifieke antilichaam-medicijn conjugatie voor kankertherapie. Bij deze techniek wordt het variabele domein van een antilichaam, hierin het tumor bindende deel, samen gevoegd met het constante domein wat dient als herkenningspunt voor potentieel cytotoxische medicijnen. Dit chimere antilichaam dient hierin als herkennings- en bindingspunt voor de medicatie, waardoor alleen de kankercellen te maken zouden krijgen met het medicijn. Voor dit soort therapieën wordt vooral gebruik gemaakt van het antilichaam IgG (S. Panowksi, 2014).